Biopolym. Cell. 2025; 41(4):300.
http://dx.doi.org/10.7124/bc.000B2C
Біоорганічна хімія
Оцінювання монометин-ціанинового барвника FB128 для застосування в ПЛР в реальному часі
1Казаков-Кравченко О. С., 1, 2Кравченко С. А., 1Ярмолюк С. М.
  1. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
    Вул. Академіка Заболотного, 150, Київ, Україна, 03143
  2. Київський інститут національної гвардії України, МВС України
    вул. Оборони Києва 7, Київ, Україна, 03179

Abstract

Мета. Оцінити придатність нового барвника fb128, що проявляє афінні властивості до ДНК, для застосуванняв ПЛР в реальному часі, включаючи ефективність ампліфікації, флуоресцентні характеристики, поріг інгібування ПЛР та аналіз кривої плавлення. Методи. Спектроскопія поглинання в УФ-видимому діапазоні та флуоресцентна спектроскопія, електрофорез в агарозному гелі, ПЛР в реальному часі, аналіз кривої плавлення. Результати. fb128 продемонстрував низьку власну флуоресценцію та сильний ДНК-специфічний сигнал (ΔQ = 160,7). Оптимальні концентрації (0,2—1,6 мкМ) забезпечили ранні значення Ct без інгібування ПЛР, тоді як ≥ 3 мкМ спричиняли інгібування ампліфікації або повне пригнічення. Ефективність ПЛР з fb128 становила 102,6%, що знаходиться в оптимальному діапазоні для кількісних застосувань. Піки плавлення з fb128 були сильнішими і з’являлися при 74,5 °C, що на 2,5 °C нижче, ніж з SYBR Green I, що свідчить про слабше зв’язування з дволанцюговою ДНК. Висновки. fb128 демонструє високу ефективність ампліфікації, сильний флуоресцентний сигнал, широку толерантність до концентрації та надійну продуктивність аналізу плавлення. Ці властивості виділяють fb128 як конкурентоспроможну альтернативу SYBR Green I для застосувань ПЛР у реальному часі.
Keywords: монометин-ціаніновий барвник, інтенсивність флуоресценції, ПЛР у реальному часі, ДНК-зв'язування, ефективність ПЛР, аналіз кривої плавлення
Повний текст: (PDF, англійською)

References

[1] Bermingham N, Luettich K. Polymerase chain reaction and its applications. Current Diagnostic Pathology. 2003; 9(3):159-64.
[2] Maksymchuk O, Gerashchenko G, Rosohatska I, Kononenko O, Tymoshenko A, Stakhovsky E, Kashuba V. Cytochrome P450 genes expression in human prostate cancer. Mol Genet Metab Rep. 2024; 38:101049.
[3] Sun L, Wang L, Zhang C, Xiao Y, Zhang L, Zhao Z, Ren L, Peng J. Rapid Detection of Predominant SARS-CoV-2 Variants Using Multiplex High-Resolution Melting Analysis. Microbiol Spectr. 2023; 11(3):e0005523.
[4] Karelov AV, Borzykh OI, Kozub NO, Sozinov IO, Yanse LA, Sozinova OI, Tkalenko HM, Mishchenko LT, Blume YaB. Current Ap-proaches to Identification of Fusarium Fungi Infecting Wheat. Cytol Genet. 2021; 55:433-46.
[5] Navarro E, Serrano-Heras G, Castaño MJ, Solera J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 2015; 439:231-50.
[6] Josefsen MH, Löfström C, Sommer HM, Hoorfar J. Diagnostic PCR: comparative sensitivity of four probe chemistries. Mol Cell Probes. 2009; 23(3-4):201-3.
[7] Arikawa E, Sun Y, Wang J, Zhou Q, Ning B, Dial SL, Guo L, Yang J. Cross-platform comparison of SYBR Green real-time PCR with TaqMan PCR, microarrays and other gene expression measurement technologies evaluated in the MicroArray Quality Control (MAQC) study. BMC Genomics. 2008; 9:328.
[8] Morrison TB, Weis JJ, Wittwer CT. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques. 1998; 24(6):954-62.
[9] Bengtsson M, Karlsson HJ, Westman G, Kubista M. A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2003; 31(8):e45.
[10] Gudnason H, Dufva M, Bang DD, Wolff A. Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature. Nucleic Acids Res. 2007; 35(19):e127.
[11] Mao F, Leung WY, Xin X. Characterization of EvaGreen and the implication of its physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol. 2007; 7:76.
[12] Kulyk O, Krivoshey A, Kolosova O, Prylutska I, Vasiliu T, Puf R, Mocci F, Laaksonen A, Perepelytsya S, Kobzev D, Svoiakov R, Tkachuk Z, Tatarets A. Nucleic acid-binding bis-acridine orange dyes with improved properties for bioimaging and PCR applications. J Mater Chem B. 2024; 12(46):11968-82.
[13] Eischeid AC. SYTO dyes and EvaGreen outperform SYBR Green in real-time PCR. BMC Res Notes. 2011; 4:263.
[14] Kazakov-Kravchenko OS, Balanda AO, Losytskyy MYu, Yarmoluk SM. Effect of DNA, RNA and HSA on the spectral-luminescent proper-ties of several monomethine cyanine dyes. Biopolym Cell. 2025; 41(2):121.
[15] Soloviov O, Hryschenko N, Livshits L. Spinal muscular atrophy carrier frequency in Ukraine. Russ J Genet. 2013; 49(9):982-3.
[16] Horáková H, Polakovičová I, Shaik GM, Eitler J, Bugajev V, Dráberová L, Dráber P. 1,2-propanediol-trehalose mixture as a potent quantitative real-time PCR enhancer. BMC Biotechnol. 2011; 11:41.
[17] Diotallevi A, Buffi G, Barocci S, Ceccarelli M, Bencardino D, Andreoni F, Orlandi C, Ferri M, Vandini D, Menzo S, Carlotti E, Casabianca A, Magnani M, Galluzzi L. Rapid monitoring of SARS-CoV-2 variants of concern through high-resolution melt analysis. Sci Rep. 2023; 13(1):21598.
[18] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001; 25(4):402-8.
[19] Kuang J, Yan X, Genders AJ, Granata C, Bishop DJ. An overview of technical considerations when using quantitative real-time PCR analysis of gene expression in human exercise research. PLoS One. 2018; 13(5):e0196438.
[20] Hryshchenko NV, Yurchenko AA, Karaman HS, Livshits LA. Genetic Modifiers of the Spinal Muscular Atrophy Phenotype. Cytol Genet. 2020; 54(2):130-6.
[21] Haviaz VO, Bratyshchenko AS, Skrypnikova OS, Kariaka SV, Honcharenko AI, Todoryshyn DP, Khokhliuk OA, Rosohatska IV, Kashuba VI, Kononenko OA, Vikarchuk MV, Panasenko GV, Mankovska OS. Non-invasive biomarkers for bladder cancer: a study on lncRNAs and DNA methylation. Biopolym Cell. 2025; 41(1):52-62.
[22] Chen S, Zhang W, Tang Z, Lu T, Wan C, Jin W, Li J. The Detection and Differentiation of Pigeon Adenovirus Types 1 and 2 via a High-Resolution Melting Curve Platform. Microorganisms. 2025; 13(6):1331.